Биотестирование воды в домашних условиях,

Актуальность очистки водопроводной воды

Вода из водопровода требует очистки даже в том случае, если дом недавно построен и все коммуникации новые. Речь об обязательной очистке водопроводной воды идет в том случае, если дом уже очень старый, износ водопроводных труб высокий. Вода, поступающая из водопровода, подвергается различным методам очистки, если имеет мутный цвет, неприятный запах, слишком жесткая, содержит избыточное количество хлорных соединений и повышенное количество растворенного железа.

Вода в частных домовладениях, в зависимости от источника получения, может быть насыщена солями тяжелых металлов, органическими и неорганическими составляющими, нефтепродуктами, даже вирусами и бактериями. Чтобы выбрать правильный способ очистки, лучше провести предварительный анализ воды, который выявит количественные и качественные показатели всех составляющих.

Вода в частных домовладениях, в зависимости от источника получения, может быть насыщена солями тяжелых металлов, органическими и неорганическими составляющими, нефтепродуктами, даже вирусами и бактериями. Чтобы выбрать правильный способ очистки, лучше провести предварительный анализ воды, который выявит количественные и качественные показатели всех составляющих.

Биотестирование воды в домашних условиях,

«Я утверждаю, что все рождающееся от земли живет за счет земной влаги,

и в каком состоянии находится эта влага, в таком

состоянии находится и растение»

Гиппократ

Ведение

Эти слова, сказанные Гиппократом еще в глубокой древности, не потеряли свою актуальность и сейчас. В наше время общество осознало опасность токсического загрязнения поверхностных вод и пришло к необходимости введения в практику мониторинга совершенно новых нетрадиционных подходов, в частности биологического тестирования. Биотестирование – исследование влияния различных веществ на живые организмы. Широкое внедрение методов биотестирования в практику оценки качества вод – настоятельная необходимость времени, так как никакая даже самая современная аналитическая химия не даст полной информации о токсичности среды. К тому же анализ существующих методов оценки качества природных вод показал, что биотестирование – наиболее точный, быстрый и дешёвый способ охраны природных вод. [1]

В своем исследовании с помощью данного метода мы решили выяснить, в каком же состоянии находится вода нашего города, которую мы пьем и которой поливаем растения, используемые нами в пищу.

Гипотеза: с помощью методов биотестирования можно оценить степень загрязнения

Объект исследования: степень загрязнения природных вод г.Пятигорска.

Предмет исследования: однолетние растения семейства Злаковые (Gramíneae): овёс, ячмень, пшеница, однолетние растениясемейства Капустные, или Крестоцветные (Brassicaceae) – кресс-салат и редис.

Цель данной работы оценить загрязнение природных вод г.Пятигорска по проросткам различных растений-индикаторов.

Задачи:

провести анализ теоретических подходов в изучении данной темы;

освоить методику биотестирования;

установить сезонную динамику токсичности природных вод г.Пятигорска;

определить зависимость развития тест-растений от токсичности природных вод.

1. Литературный обзор.

Методы биотестирования.

Одной из главных причин негативных последствий антропогенного загрязнения природных сред является токсичность загрязняющих веществ для биоты. Именно присутствие токсикантов в окружающей среде приводит к гибели всего живого, выпадению из состава сообществ организмов обитателей чистых зон и замене их эврибионтными видами. Существуют различные физические и химические методы определения токсичности окружающей среды, но в последнее время стали широко использоваться и биологические методы позволяющие провести оценку состояния живых организмов (Приложение 1).

Ведь говоря о загрязнении воды, почвы, атмосферы, об их токсичности мы имеем в виду, то насколько они благоприятны для обитания в них живых организмов, для здоровья человека.К числу наиболее радикальных приёмов относятся методы токсикологического биотестирования. Под биотестом понимается испытание в строго определённых условиях действия вещества или комплекса веществ на водные организмы посредством регистрации изменений того или иного биологического показателя исследуемого объекта по сравнению с контролем. Исследуемые организмы называются тест-объетами, а опыт биотестированием (Лысенко, 1996). Этот дешевый и универсальный метод в последние годы широко используется во всем мире для оценки качества объектов окружающей среды. В России с 1996 года начат эксперимент по внедрению методов биотестирования сточных вод, сбрасываемых в природные водоемы и подаваемых на сооружения биологической очистки.[5] С помощью биотестирования можно получить данные о токсичности конкретной пробы, загрязненной химическими веществами антропогенного или природного происхождения. Этот метод позволяет дать реальную оценку токсичности свойств какой-либо среды, обусловленной присутствием комплекса загрязняющих веществ и их метаболитов. Живые организмы всегда в той или иной степени реагируют на изменение окружающей среды, но в ряде случаев это нельзя выявить физическими или химическими методами, так как разрешающие возможности приборов или химических анализов ограничены. Чувствительные же организмы – индикаторы реагируют не только на малые дозы экологического фактора, но и дают адекватную реакцию на воздействие комплекса факторов (Груздева, 2002). [3].

Биотестирование позволяет установить районы и источники загрязнения. В качестве тест-объектов используются бактерии, водоросли, высшие растения, пиявки, дафнии, моллюски, рыбы и другие организмы. В порядке возрастания толерантности к загрязнениям организмы располагаются в следующий ряд: грибы, лишайники, хвойные, травянистые растения, листопадные растения. Каждый из них имеет преимущества, но, ни один не является универсальным, самым чувствительным ко всем веществам. Для гарантированного выявления присутствия в природных водах токсического агента неизвестного химического состава нужно использовать набор тест-объектов, представляющих различные группы организмов. При выборе тест-организмов исходят из видовой токсичности возможных загрязнителей, особенностей водоема и требований водопотребителей. Для тест-организмов могут быть выделены частные интегральные тест-функции. Интегральные параметры характеризуют состояние системы наиболее обобщённо. Для организмов к интегральным относят характеристики выживаемости, роста, плодовитости. Частными для организма, например, могут быть физиологические, биохимические и гистологические параметры. [6]

Биотестирование природных вод.

Биотестирование природных вод стало широко применяться в научно- исследовательских работах с начала 80-х годов (Приложение 2). Это объясняется существенным увеличением уровня загрязнения водных объектов и надеждами специалистов на то, что биотестирование сможет хотя бы частично заменить химический анализ вод, так как в водные объекты ежегодно сбрасывается около 55 км 3 сточных вод, из которых 20 км 3 загрязнен. (Степановских, 2001). До нормативного качества очищается лишь около 10% вод требующих очистки (Яблоков, 2005). [9]

В 1991г. биотестирование введено как обязательный элемент контроля качества поверхностных вод, что предусмотрено «Правилами охраны поверхностных вод» (1991). Показатели биотестирования природных вод включены в перечень показателей для выявления зон чрезвычайной экологической ситуации и зон экологического бедствия (Туманов, Постнов, 1983). [9] Методы биотестирования представляют собой характеристику степени воздействия на водные биоценозы. Так, А.М. Гродзинский Д.М. Гродзинский (1973) описывают ряд биологических проб для тестирования токсичности природных вод. [2] Согласно принятому определению, биотестирование воды – это оценка качества воды по ответным реакциям организмов, являющихся тест-объектами. Тест на прорастание семян применяется для установления воздействия различных физиологически активных веществ. В качестве индикаторов токсичности используются семена сельскохозяйственных растений. Среди сельскохозяйственных культур наиболее чувствительны салат, люцерна, злаковые, крестоцветные, а к нечувствительным видам относят кукурузу, виноград, розоцветные, подорожник (Рамад,1981). [6] Методы биотестирования должны отвечать следующим требованиям: относительная быстрота проведения, получение достаточно точных и воспроизводимых результатов, наличие, пригодных для индикации объектов в большом количестве. В настоящее время хорошо известны методы биотестирования, ориентированные на определение токсичности водной среды, обусловленной присутствием определенных групп химических соединений, в частности фосфорорганических. Наиболее апробирован на природных водах ферментативный метод В.И. Козловской. [4]

Достоинства методов биотестирования.

Главные достоинства биотестирования – простота и доступность приемов ее постановки, высокая чувствительность тест-организмов к минимальным концентрациям токсических агентов, быстрота, отсутствие надобности в дорогостоящих реактивах и оборудовании. По мнению ряда авторов ни один из отдельно взятых организмов не может служить универсальным тест-объектом к веществам различной химической природы, следовательно, для гарантированного выявления в среде токсичного агента должен использоваться набор биотестов (Брагинский и др. 1979; Лесников, 1983; Филенко, 1989). [9]

Методами биотестирования выявляется токсичность, которая является интегральным показателем загрязнения природных сред. Как и все интегральные показатели, они имеют тот недостаток, что не раскрывают индивидуальные загрязняющие вещества, присутствующие в пробе. Работ по биотестированию водной среды опубликовано множество, но они были сделаны главным образом с целью оценки токсичности вновь синтезируемых химических препаратов, препаратов, приобретаемых по импорту, а также при разработке регламентов на химические соединения. Гораздо меньше публикаций по биотестированию сточных вод и ещё меньше – по биотестированию природных вод (Никаноров, Хоружая, 2001). [1]

Методы биоиндикации, позволяющие изучать влияние техногенных загрязнителей на растительные и животные организмы на неживую природу являются наиболее доступными. Биоиндикация основана на тесной взаимосвязи живых организмов с условиями среды, в которой они обитают. Изменения этих условий, например повышение солености или рН воды может привести к исчезновению определенных видов организмов, наиболее чувствительных к этим показателям и появлению других, для которых такая среда будет оптимальной. [2]

Существуют разные биологические индикаторы. О наличии некоторых загрязнителей можно судить по внешним признакам растений и животных. Благодаря «памяти» этих организмов, можно узнать и о роли тех факторов, которые в настоящее время уже не действуют. Например, появление черных пятен на листьях липы рассказывает о том, что в зимнее время дворники чрезмерно увлекались посыпанием снега солью для ускорения его таяния, о выбросах сернистого газа расскажут пятна на листьях подорожника большого. По ширине годичных колец сосен в окрестностях химического предприятия можно определить, в какие годы завод особенно сильно загрязнял среду. В годы сильного загрязнения атмосферы закладываются более тонкие кольца. По высоте некоторых растений можно судить о концентрации солей в воде. Так, например, тростник может достигать высоты 4 м, но если содержание солей в воде высокое — это растение не вырастет более чем на 0,5 м. Индикаторами загрязнения атмосферы являются некоторые мхи и лишайники. Например, при анализе лишайников в Швеции было установлено появление радиоактивной пыли от Чернобыльской АЭС. Существуют специальные живые приборы — бриометры — маленькие коробочки со мхами определенных видов, по которым определяют режим задымления атмосферы. [9]

Практическая часть.

Исследования проводились по методикам, предложенным А.И. Федоровой и А.Н. Никольской в «Практикуме по экологии и охране окружающей среды», 2003, а также в учебном пособии для вузов «Экологический мониторинг» под редакцией Т.Я. Ашихминой, 2005. [7] [8]

Работа по изучению метода биотестирования токсичности природных вод по проросткам растений индикаторов выполнялась в течение 2015 года.

Все исследования по теме проводились в лаборатории кабинетов химии и биологии МБОУ СОШ №5 г. Пятигорска в дневное время, при сочетании искусственного и естественного освещения в стандартных, оптимальных для тест-растений условиях. Оценить уровень загрязнения водоемов можно, используя тест на прорастание семян. Такое тестирование проводится как предварительное для выявления особенно загрязненных водоемов с целью последующего химического анализа. В качестве тест-растений были использованы проростки высших растений: пшеницы, ячменя, овса, кресс-салата, редиса. Предлагаемый метод биологической оценки токсичности природных вод по проросткам растений индикаторов проводился в двух вариантах:

1.Полив проростков тест-растений испытуемой водой.

2. Накапывание испытуемого раствора между семядолями двудольных растений.

В качестве тест-растений в первом варианте применяли семена пшеницы, овса, ячменя. Во втором варианте были использованы только проростки двудольных растений: кресс-салата, редиса.

Из всех используемых в исследованиях растений кресс-салат обладает повышенной чувствительностью к загрязнению воды тяжелыми металлами. Этот биоиндикатор отличается быстрым прорастанием семян и почти 100% всхожестью, которая заметно уменьшается в присутствии загрязнителей. Кроме того, побеги и корни кресс-салата под действием загрязнителей подвергаются заметным морфологическим изменениям (задержка роста и искривление побегов, уменьшение длины и массы корней) (Голубкина, 2008). [9]. С целью профилактики перед проращиванием семена протравливали. Сухие семена погружали в 1%-ный раствор марганцовокислого калия на 0,5 часа, а затем промывали дистиллированной водой, используя два слоя марли, обсушивали на фильтровальной бумаге на воздухе.

Метод полива проростков тест-растений испытуемой водой

(1 вариант).

За 2-3 дня до опытов (сроки прорастания семян выяснялись заранее) семена тестовых объектов, пшеницы, овса, ячменя, замачивались на сутки в воде. Затем раскладывались пинцетом зародышем вверх (в одном направлении) в кювету, на дно которой был уложен слой гигроскопической ваты, а сверху – два слоя фильтровальной бумаги. Система увлажнялась водопроводной водой до полной влагоёмкости. Для этого вода наливалась под вату, а после её впитывания удалялся избыток. Кювета накрывалась плёнкой, края плёнки подгибались под кювету. Проращивание производилось при температуре +25 0 С – +26 0 С до размера основной массы проростков 10-15мм и появления корней, после чего ростки разделяют на фракции по длине.

В стаканчики помещают одинаковое количество промытого и покалённого песка, в каждый стаканчик высаживают по 10 одинаковых проростков тест-растений. Песок поливают сверху одинаковым количеством испытуемой воды из разных водоёмов. Повторность – трёхкратная. Контроль – полив отстоянной и очищенной водопроводной водой. После достижения ростками высоты 8-10см их выкапывают, обсушивают фильтровальной бумагой, разделяют бритвой на части (стебель, корни), измеряют и взвешивают. Данные обрабатывают статистически, выражают в процентах к контролю.

Метод полива проростков тест-растений испытуемой водой

(2 вариант).

Воду, взятую из различных источников, концентрируют упариванием в 10 раз, хранят в холодильнике. Стаканчики наполняют одинаковым количеством промытого и прокалённого песка, вставляют стеклянную трубочку до дна, через которую производят полив, отстоянной водопроводной водой. 18-20 штук всхожих семян (кресс-салат, редис) высевают на небольшую глубину. После того, как ростки взойдут и раскроются семядоли, в стаканчиках оставляют по 10 одинаковых растений, остальные выщипывают пинцетом. Полив субстрата для выращивания производят одинаковым количеством воды через трубочку, используя воронку из фольги. Через 2-3 недели осторожно выкапывают проростки, промывают, обсушивают фильтровальной бумагой, измеряют и взвешивают отдельно надземную часть и корни. Данные обрабатывают статистически, выражают в процентах к контролю.

Развитие проростков тест-растений при поливе их испытуемой водой (весенний период).

Исследования проводились по методикам, предложенным А.И. Федоровой и А.Н. Никольской в «Практикуме по экологии и охране окружающей среды», 2003, а также в учебном пособии для вузов «Экологический мониторинг» под редакцией Т.Я. Ашихминой, 2005. [7] [8]

Какие отходы относят к 5 классу опасности

К пятому классу относятся:

  • Древесно-стружечные материалы.
  • Зола.
  • Некоторые пищевые отходы (скорлупа яиц).
  • Щебень и кирпичный бой.
  • Куски цемента.
  • Брак производства ламп накаливания и отработанные устройства.
  • Керамический бой.
  • Металлолом, металлостружка (стальная, алюминиевая).
  • Макулатура и т. д.

Производители отходов 5-го класса опасности, выступающие малыми или средними предпринимателями, должны каждый год отчитываться по отходам МПС.

Провести биологическую экспертизу отходов имеет право только лабораторная организация с соответствующей аккредитацией.

Скачать:

ВложениеРазмер
chikin_voda.docx34.81 КБ

Сравнение позволяет установить сходство и различие предметов и явлений действительности. Проводилось сравнение разных образцов воды.

биологические науки

  • Дьяконова Зинфира Фагдановна , магистр, студент
  • Чудинова Татьяна Петровна , кандидат наук, доцент, преподаватель
  • Махмутов Айнур Рашитович , кандидат наук, доцент, преподаватель
  • Башкирский государственный университет, Бирский филиал
  • ПИТЬЕВАЯ ВОДА
  • ТЯЖЕЛЫЕ МЕТАЛЛЫ
  • ТЕСТ-ОБЪЕКТ
  • БИОИНДИКАЦИЯ

Концентрацию клеток инфузории определяли при помощи фотометра «Биотестер — 2м». Использовали классификацию: допустимая степень токсичности (0,00 0,70).

Биотестирование как интегральный метод оценки качества воды

Значительное время контроль за загрязнением окружающей среды осуществлялся только физико-химическими методами, путем определения концентраций загрязнителей и соблюдением соответствия величин измеренных концентраций нормированных показателей предельно-допустимым концентрациям (ПДК). С развитием химической промышленности, синтезом новых соединений и их использованием в производстве перечень контролируемых загрязнителей в составе сточных вод увеличивается с каждым днем. Сегодня много загрязняющих веществ по разным причинам не контролируется: для одних не разработаны ПДК, для других отсутствуют утвержденные методики определения, а их воздействие испытывает окружающая среда. В результате поучается так, что широкий спектр соединений, токсичных веществ в водной, воздушной и почвенной средах не контролируется. Но и в случае контроля полного спектра соединений в среде на уровне ПДК нельзя утверждать об отсутствии вредного воздействия на окружающую среду. Так как информация физико-химических показателей не позволяет в принципе сделать вывод о совокупном воздействии загрязняющих веществ различной природы на живые организмы и степени их опасности.

Заполнить информационный аналитический вакуум о комбинационном воздействии загрязнителей признаны методы биотестирования. Особенность информации, получаемой с помощью методов биотестирования состоит в интегральном характере отражения всей совокупности свойств испытуемой среды с позиции восприятия ее живых объектом. И в отличии от физико-химических методов, посредством которых определяется валовое содержание того или иного загрязнителя, биотестовые методы анализа качества воды позволяют обнаружить физиологически активные формы соединений, влияющие на организм. Так, например, нет возможности разрабатывать ПДК веществ под различные значения рН среды, а именно изменение рН среды влечет за собой образование иных форм соединений, возможно более токсичных. Или же токсическое действие токсикантов усиливается в мягкой воде нежели чем в жесткой. А комплексное воздействие загрязнителей совсем непредсказуемо.

Изучено и выделены несколько вариантов воздействия токсикантов.

1. Антагонистическое воздействие токсикантов – возможно такое сочетание ионов в комбинации которых эффект токсичности будет меньше.

2. Аддитивный эффект – эффект токсичности суммы токискантов равен сумме эффектов токсичности.

3. Синергический эффект – неполное суммирование эффектов токсичности.

4. Сеисибилизационный эффект – комбинация токсикантов усиливает эффект токсичности.

Сегодня биотестовые методы, как необходимое дополнение к химическому анализу включены в стандарт по контролю качества вод различного назначения.

Принцип биотестирования сводится к регистрации изменения биомассы, выживаемости, плодовитости, а также физиологических или биохимических показателей тест-объекта в испытуемой среде.

В настоящее время в мире используется большое разнообразие тест-объектов: от одноклеточных водорослей, мхов и лишайников, бактерий и простейших микроорганизмов до высших растений, рыб и теплокровных животных.

В России в органах государственного аналитического контроля за качеством воды дафниевый тест рекомендован в качестве основного для контроля токсичности сточных вод и перспективного для оценки уровня токсического загрязнения природных вод. Дафниевый тест обязателен при установлении ПДК отдельных веществ в воде рыбохозяйственных водоемов.

Выбор тест-объекта определен следующим: 1) этот род ветвистоусых рачков распространен повсеместно в пресных водоемах, является важной составной частью зоопланктона, служит источником пищи молоди рыб; 2) легко культивируется в лабораторных условиях – испытания загрязняющих веществ можно проводить в течении года; 3) определяющая особенность -это то, что по характеру питания они являются фильтраторами и прокачивают большие объемы воды, отфильтровывая в качестве пищи бактерий и микроводоросли, поэтому, если в воде присутствует токсикант даже маленькой концентрации из-за объема отфильтрованной воды чувствительность тест-объекта высокая.

Дафниевый метод биотестирования основан на определении изменений выживаемости и плодовитости дафний при воздействии токсических веществ, содержащихся в тестируемой воде по сравнению с контролем.

Выделяют кратковременное биотестирование – до 96 час. Позволяет определить острое токсическое действие испытуемой воды на дафний по их выживаемости. Показателем выживаемости служит среднее количество особей, выживших в тестируемой воде или в контрольной за определенное время. Критерием токсичности является гибель 50% и более дафний за период времени до 96 час. в тестируемой воде по сравнению с контролем.

Длительное биотестирование – 20 и более суток – позволяет определить хроническое токсическое действие испытуемой воды на дафний по снижению их выживаемости и плодовитости. Показателем выживаемости служит среднее количество исходных самок-дафний, выживших в течение биотестирования, показателем плодовитости – среднее количество молоди, выметанной в течение биотестирования, в пересчете на одну выжившую исходную самку. Критерием токсичности является достоверное отличие от контроля показателя выживаемости или плодовитости дафний.

Выше было упомянуто о большом количестве тест-объектов, использующих в биотестировании и это неслучайно. Дело в том, что различные организмы по разному реагируют на загрязнители. И задача природоохранных органов правильно оценить ситуацию и выбрать более чувствительный тест-объект.

Пример. Результаты биотеетироваиия сточных вод завода,
синтезирущего биологические активные соединения гербицидного
направления, могут быть различными в зависимости от выбранного тест-
обьекта. Дафниевый тест может показать отсутствие токсического
воздействия, а культура водорослей может почувствовать токсикант.
Почему? Дело в том, что предполагаемый токсикант, синтезируемые
гербициды являются ингибиторами процессов фотосинтеза у растений и
водорослей. Поэтому дафнии могут в кратковременном опыте зафиксировать
отсутствие острого токсического воздействия, а водоросли в случае
нарушения работы фотосинтетической цепи оперативно отреагируют на
загрязненность.

Поэтому в системе контроля за качеством сточных вод также рекомендованы водоросли: хлорелла и сцепедесмус. Критерием токсичности при биотестирозании с использованием водорослей служит достоверное снижение количества клеток в испытуемой воде по сравнению с контролем.

С целью быстрого получения информации о качестве воды используются экспресс методы биотестирования.

В Москве разработан и выпускается мелкими .партиями прибор “Биотоке”. Устройство Биотоке – это портативный биолюминометр,

позволяет с помощью биосенсора “Эколюм”, светящиеся бактерии, производить быстрое и объективное определение индекса обшей токсичности водных образцов, включая металлы, препараты бытовой химии и т.д. Результаты токсичности пробы воды получают через 10 мин.

В Санкт-Петербурге выпускается прибор Биотестер. В качестве тест-объекта используют одноклеточные микроорганизмы – инфузории туфелька. Этот метод основан на хемотаксической реакции организмов в ответ на загрязнитель, т.е. движение культуры в благоприятную зону. Данная тест-реакция – хемотаксис, является очень чувствительной к токсикантам определенной группы.

В России биотестирование проводят аналитические лаборатории органов природоохраны для определения токсичности сточной воды (происходят ли патологические изменения или гибель организмов, обусловленные присутствием в ней токсических веществ) на сбросе в водный объект, воды в контрольном и других створах водопользования с целью проверки соответствия качества воды нормативным требованиям:

– сточная вода на сбросе в водный объект не должна оказывать острого токсического действия, а вода в контрольном и других створах водопользования – хронического токсического действия на тест-объекты.

В соответствии с “Методическим руководством по биотестированию воды РД 118-02-90”, биотестирование является дополнительным экспериментальным приемом для проверки необходимости корректировки величин ПДС по интегральному показателю “токсичность воды”, который позволяет учесть ряд существенных факторов: наличие в сточной воде токсических веществ, неучтенных при установлении ПДС, вновь образованных соединений, метаболитов, различные виды взаимодействия химических веществ. Необходимость корректировки величин ПДС возникает в том случае, если при биотестировании воды из контрольного створа водного объекта установлено несоответствие ее качества требуемому нормативу: вода в контрольном створе водного объекта не должна оказывать хронического токсического действия на тест-объекты (дафний и цероидафний).

Для оценки бактериального загрязнения используются санитарно-бактериологические и гидробиологические показатели.

Микронаселение природных вод чрезвычайно разнообразно. Его качественный и количественный состав определяется в первую очередь составом воды. Для глубоко залегающих, очень чистых артезианских вод характерно почти полное отсутствие бактерий вследствие защищенности водоносного слоя от контакта с лежащими выше горизонтами.

Особенностью состава воды открытых водоемов является изменение его по сезонам года: сопровождающееся изменениями в количестве и видовом разнообразии микронаселения. Бактериальная загрязненность поверхностных источников обусловлена, главным образом, поступлением в водоемы поверхностного стока, содержащего органические, минеральные вещества и микроорганизмы, смываемые с площади водосбора, и сточных вод.

С позиций санитарной микробиологии оценка качества воды проводится
с целью определения ее санитарно-эпидемиологической опасности или
безопасности для здоровья-человека. Вода играет важную роль в передаче
возбудителей многих инфекций; главным образом кишечных. Т.к. через воду
получают распространение брюшной тиф, дизентерия, холера,
инфекционный гепатит и т.д.

Прямое количественное определение возбудителей всех инфекций для контроля за качеством воды неосуществимо в связи с многообразием их видов и трудоемкостью анализа. В практической санитарной микробиологии поэтому прибегают к косвенным методам, позволяющим определить потенциальную возможность заражения воды патогенными микроорганизмами.

Санитарно-бактериологическая оценка качества воды основана на определении двух основных показателей; микробного числа и числа бактерий группы СоН.

Первый показатель даст представление об общей обсемененности воды аэробными сапрофитами, поэтому часто называется общим счетом аэробных сапрофитов или (кратко) общим счетом. Микробное число определяют методом посева на стандартную среду – мясопептонный агар (МПЛ).

Аэробные сапрофиты составляют только часть общего числа микробов в воде, но являются важным санитарным показателем качества воды, так как между степенью загрязнения ее органическими веществами и микробным числом существует прямая зависимость. Кроме того, полагают, что чем выше микробное число, тем больше вероятность присутствия в воде патогенных микроорганизмов. Микробное число водопроводной воды не должно превышать 100. В природных водах этот показатель изменяется в очень широких пределах для разных водоемов и по сезонам года для одного и того же водоема. В чистых водоемах число аэробных сапрофитов может исчисляться десятками или сотнями, а в загрязненных и грязных водоемах составлять десятки тысяч и миллионы.

По второму показателю – числу бактерий группы СоН (кишечная палочка) оценивают возможное присутствие в воде патогенных микроорганизмов.

Бактерии группы СоН относятся к семейству энтеробактерий. Это неспороносные палочки, факультативные анаэробы, сбраживающие лактозу и глюкозу при температуре 37°С с образованием кислоты и газа и не обладающие оксидазной активностью. Они являются постоянными сожителями кишечника человека и животных: постоянно и в большом числе выделяются во внешнюю среду; дольше, чем патогенные микроорганизмы, сохраняют жизнеспособность в этой среде; более устойчивы к хлору, чем возбудители большинства инфекций. Именно эти свойства бактерий группы СоИ обусловили возможность их использования в качестве санитарно-показательных микроорганизмов. Наличие коли-форм в воде говорит о ее фекальном загрязнении, а их число позволяет судить о степени этого загрязнения. Для количественного определения коли-форм применяют фуксин-сульфитный агар (среда Эндо).

Анализ водопроводной и чистой природной воды проводят после предварительного концентрирования воды на мембранных фильтрах.

Результаты выражают в виде коли-индекса – числа бактерий в 1 л воды.

Иногда делают пересчет, определяя коли-титр – наименьший объем воды (в мл), содержащий одну кишечную палочку. Коли-титр = 1000/коли-индекс.

Коли-индекс водопроводной воды должен быть не более 3. Допустимый коли-индекс воды источников водоснабжения зависит от предполагаемого способа очистки. Если намечается только хлорирование воды, то коли-индекс воды в источнике не должен превышать 1000 при полной очистке воды – 10000.

В особых условиях по санитарно-эпидемиологическим показателям прибегают к определению в воде – энтерококков, энтеровирусов сальмонелл и проводят исследования воды на патогенную микрофлору.

Поверхностные источники водоснабжения помимо санитарно-бактериологических тестов характеризуются также данными гидробиологических наблюдений. Микроскопированием пробы воды определяется число клеток фито- и зоопланктона. Эти показатели существенно изменяются по сезонам – как по количеству организмов, так и по их видовому разнообразию.

В весенне-летний период интенсивного развития водорослей (цветения водоема) содержание фитопланктона в поверхностных водах может достичь 50 тыс. клеток в 1 мл. Летом зоопланктон отличается большим разнообразием и представлен низшими ракообразными, коловратками, личинками моллюсков. В воде могут оказаться и бентосные организмы: черви, личинки насекомых. В зимний период в воде встречаются, в основном, низшие ракообразные. Число организмов зоопланктона обычно выражают числом экземпляров в 1 м3 воды. В воде источников встречаются также организмы, видимые невооруженным глазом. Их число оценивают числом экземпляров в 1 м3. Для рек средней полосы европейской части нашей страны концентрация зоопланктона составляет 100- 10000 экз. в 1 м воды. Обычно их в несколько раз меньше, чем организмов зоопланктона.

В питьевой воде планктонные организмы, так же как организмы видимые невооруженным глазом, должны отсутствовать.

В особых условиях по санитарно-эпидемиологическим показателям прибегают к определению в воде – энтерококков, энтеровирусов сальмонелл и проводят исследования воды на патогенную микрофлору.

Диплом преподавателя

В качестве тест – растений в первом варианте применяли семена пшеницы, овса, ячменя. Во втором варианте были использованы только проростки двудольных растений: кресс – салата, редиса.

Методы лабораторного анализа питьевой воды

Анализ питьевой воды позволяет точно понять, пригодна ли она для употребления человеком или может быть опасна для здоровья. Лабораторные исследования могут проводиться в разных вариантах, все зависит от поставленной задачи (от простого анализа на жёсткость до многоступенчатого исследования пробы на включение в состав редких элементов). Выбор методики зависит от типа пробы (из водопровода или забор на природе) и цели исследования. Есть контроль качества, соответствие нормам, степень превышения включения в состав примесей относительно ПДК. Стоит подробнее изучить вопросы о том, что включает в себя анализ, как проводится и какова его стоимость.


Первостепенно нужно определение элементарного состава воды (30 самых распространенных химических элементов). Второй момент — выявление присутствия в нем дополнительных химических веществ, если это нужно или если проба имеет особенности (забор воды из грязных водоносных горизонтов или стоки промышленного предприятия).

2.2 Условия выполнения биотестирования

Биотестирование проводят в помещении, где не хранят и не работают с летучими веществами, не используют обработку помещения инсектицидами.

Объем пробы воды для определения острой летальной токсичности должен быть не менее 1 дм3.

Температура анализируемой пробы при биотестировании должна быть (20±2)°С, концентрация кислорода в пробе в начале биотестирования – не менее 6 мг/дм3. Если его концентрация ниже 6 мг/дм3, пробу аэрируют микрокомпрессором. Воздух должен подаваться равномерно до достижения концентрации кислорода 6 мг/дм3. Во время биотестирования пробу не аэрируют.

Битестирование проводят при рассеянном свете. Не допускается попадание прямых солнечных лучей на тест-объект. Длительность светового периода соответствует естественному. Рекомендуется использовать термолюминостат.

Плотность посадки односуточных дафний в опыте и контроле должна составлять 10 экземпляров на 100 см3. Повторность трехкратная.

Битестирование проводят при рассеянном свете. Не допускается попадание прямых солнечных лучей на тест-объект. Длительность светового периода соответствует естественному. Рекомендуется использовать термолюминостат.

Использование организмов для биотестирования

Биотестирование как вид лабораторного биологического контроля проводится только на основании рекомендованных и утвержденных методик с использованием специально выращенных лабораторных организмов. Все процедуры проведения опытов и обработки результатов описываются в международных стандартах ISO (International Organisaton for Standartisation) или в природооохранных нормативных документах (ПНД) РФ, близких по содержанию к ISO (см. табл. 3.4.).

Таблица 3.4. Основные разделы нормативных документов по биотестированию

Назначение и область применения

Scope and field of application

Условия проведения теста *

Метрологические характеристики методики

Interpretation and validity of the results

Средства измерений, посуда, реактивы, материалы, растворы

Reagents and materials. Apparatus

Условия безопасного проведения работ

Требования к квалификации операторов

Условия выполнения измерений

Подготовка к выполнению измерений

Treatment and preparation of samples

Обработка и оформление результатов

Expression of results

Форма представления результата анализа

Приложение А (справочное): характеристика тест-объекта

Annex А,В,С-описание выращивания тест-объекта.

Приложение Б (обязательное): выращивание тест-объекта

Методики измерения реакции, примеры вычислений результатов

Приложение В ( обязательное ) подготовка тест-объекта к анализу

  • * Могут отсутствовать или входить в качестве подраздела.
  • ** Могут определяться дополнительными документами.

Таблицы 2.4., 3.4 содержит перечень организмов, которые рекомендованы различными стандартами биотестирования, для определения качества воды, токсичности полимеров, исследования мутагенности веществ и излучений.

За рубежом стараются применять для экологического контроля организмы, выбор которых был бы понятен не только специалистам, но и присяжным заседателям, так как результаты тестирования могут быть подвергнуты по требованию фирм судебной проверке.

Для контроля необходимо отбирать организмы с учетом следующих требований:

  • 1) хозяйственной и экологической значимости вида;
  • 2) безвредности организма для человека, изученности его возможных форм;
  • 3) чувствительности к загрязнителям окружающей среды.

При биотестировании, как правило, не используются организмы-мутанты, полученные методами генной инженерии. Предпочтение отдается видам, существующим в природе. Используются различные гидробионты – водоросли, микроорганизмы, беспозвоночные, рыбы.

Для биотестирования необходимы организмы, реагирующие на низкие концентрации загрязнителя и способные сохранять хемочувствительность при изменении (в требуемом диапазоне) других факторов окружающей среды, например температуры и кислотности. Как правило, наиболее чутко реагируют на вредные вещества организмы, живущие в пресной и проточной водах. Поэтому в биотестирование применяют пресноводные инфузории P. caudatum, дафнии, радужную форель, аквариумных рыбок вида Brahydanio (обитателей ручьев и представителей промыслового семейства карповых). Контроль реакции водорослей (Chlorella, Scenedesmus) необходим для оценки воздействия загрязнителей на фотосинтез. Водоросли могут также использоваться как стандартизированный корм для дафний и рыб. В некоторых биотестах размножение дафний контролируется косвенным методом – по выеданию ими микроскопических водорослей и, обусловленному этим процессом, изменению цвета культуральной среды.

Бактерии E.coli кишечной микрофлоры желудка человека и ферменты позволяют исследовать воздействие загрязнений водных сред на метаболизм “in vivo” и “in vitro”.

Сперматозоиды крупного рогатого скота теряют свою подвижность при попадании в среду с вытяжками вредных полимеров.

В биотестировании находят все большее распространение одноклеточные организмы. Выращивание больших популяций микроорганизмов, применяемых в биотехнических методах биологического контроля (ряда видов бактерий, грибов или их ферментов), возможно лишь в автоматических культиваторах – ферментерах. Поэтому применение подобных биообъектов предполагает наличие инфраструктуры обеспечения биологического контроля. Простейших можно получать для опытов как методами автоматизированного непропорционально-проточного культивирования, так и в обычной лабораторной посуде (в чашках Петри или пробирках).

Из табл. 2.4 видно, что искусственно синтезировать среду и корм целиком невозможно. Можно лишь обеспечить некоторую стандартизацию условий. Например, бактерии (часто используемые как первичный корм организмов) разводят на мясопептонном бульоне (МПБ) или студнеобразном агаре (МПА), которые приготавливают из мясной вырезки с добавлением солей и пептона (продукта гидролиза белка). Поэтому составы бульона и агара зависят от качества мяса. Гаметы тоже невозможно получить в полностью контролируемых условиях. Выделение из периферической крови лейкоцитов и искусственная стимуляция их деления не полностью соответствуют естественному механизму размножения кровяных клеток, что затрудняет трактовку мутаций.

Ведущее положение в различных областях мониторинга и охраны окружающей среды, в том числе в системе экологического нормирования химических веществ занимают биотестовые методы на дафниях – ветвистоусых ракообразных, относящихся к семейству Daphniidae – Daphnia magna, D. longispina, Ceriodaphnia dubia, Ceriodaphnia affinis. и др.

К достоинствам дафнии, как тест-объектам, относится:

  • – Сравнительная простота культивирования и содержания;
  • – Наглядность функциональных изменений при экстремальных воздействиях и легкость их учета;
  • – Многоклеточная организация, что делает этот объект более адекватным высшим организмам, чем широко используемые культуры одноклеточных организмов;
  • – Сравнительно высокая чувствительность к токсическим воздействиям;
  • – Всесторонняя изученность вида, что позволяет анализировать особенности механизмов действия токсического агента.

При биотестировании на дафниях можно регистрировать различные тест-реакции, но традиционными остаются выживаемость и плодовитость; среди других чаще всего используются поведенческие реакции, морфометрия и окраска тела, скорость выедания корма и др. для токсикологической оценки водной среды.

Среди простейших приоритет принадлежит представителям типа инфузорий (Ciliophora): Tetrachymena pyrifomis (Ehrenberg) Schewiakoff давно и достаточно успешно применяется для оценки токсичности и пищевой ценности продуктов питания человека и животных по снижению прироста количества простейших. Инфузории рода Paramecium, также широко используются в токсикологической практике, наиболее известные виды – Paramecium caudatum, Paramecium putrinum, Paramecium aurelia, Paramecium multinucleus. Позволяют определить по хемотаксической реакции простейших дозозависимые эффекты различных фармакологических препаратов, косметических средств, кормовых и пищевых продуктов.

Stylonychia mytilus (Способ позволяет получить оценку острой токсичности кормов. Метод широко внедрен в сельскохозяйственную практику), Colpoda steinii, Euplotes balteatus, и др.

Инфузории как тест-объекты обладают рядом достоинств:

  • – высокая чувствительность к токсикантам различной природы;
  • – короткий жизненный цикл;
  • – высокая скорость размножения;
  • – сочетание признаков эукариотной клетки и целостного организма;
  • – ярко выраженные таксисы;
  • – простота содержания в лабораторных условиях.

По сравнению с другими группами простейших, инфузории имеют наиболее сложное строение и отличаются разнообразием функций. При разработке и применении биотестов большое значение имеет его стандартизация. Культура инфузорий легко подвергается стабилизации при проточном культивировании, когда скорость роста культуры регулируется скоростью протока среды. При биотестировании на инфузориях о токсичности исследуемой пробы судят по выживаемости, интенсивности размножения, изменению двигательной активности, поведенческим (таксическим) реакциям и др.

Одни из наиболее чувствительных тест-организмов – водоросли. Важность их для биотестирования определяется тем, что, являясь первичными продуцентами, водоросли представляют собой основу пищевых цепей в природных экосистемах. В качестве тест-объектов используют представителей разных отделов водорослей, различные тест-реакции и критерии токсичности. Наиболее часто в качестве тест-организмов используют зеленые водоросли – хлореллу (Chlorella vulgaris Beijer) – изменение оптической плотности зеленых водорослей и сценедесмус (Sctnedesmus quadricauda) – изменение уровня флуоресценции хлорофилла и численности клеток зеленых водорослей.

Токсичность воды оценивается по прекращению фотосинтеза (водоросли обесцвечиваются или приобретают коричневую или желтую окраску), по отмиранию клеток, по изменению формы и окраски хроматофора и другим показателям.

Культуры одноклеточных водорослей находят широкое применение в биотестирование по следующим критериям:

  • · Отработана методика культивирования и использования водорослей для исследовательских задач;
  • · Возможна регистрация тест-реакций разного уровня интегральности – как функциональных (реакций фотосинтеза, так и популяционных, что особенно важно при оценке потенциального экологического ущерба от загрязнения;
  • · Возможно аппаратное оснащение регистрации тест-реакций;
  • · Возможно получение быстрого (минуты) ответа на появление токсического начала в окружающей среде.

Особый интерес представляют биотесты на рыбах в связи с их важностью как высшего звена в трофической цепи водных экосистем. Широко используемой в качестве объекта исследований костистой рыбы – вьюна, Misgurnus fossilis L. Принцип оценки жизнеспособности сперматозоидов по двигательной активности состоит в активации сперматозоидов в среде и регистрации их подвижности с помощью цифровой камеры или на фотопленке.

Существует целый ряд биотестов, основанных на использовании в качестве тест-организмов различных видов рыб. На первом месте среди них стоит методика биотестирования на гуппи – Poecillia reticulate Peters (По гибели).

Этот вид живородящих тропических рыбок, удобный для культивирования и наблюдений, можно отнести к чувствительным по отношению к целому ряду загрязняющих веществ. Для биотестирования природных вод пригодны и другие виды рыб. Допускается использование рыб, отловленных непосредственно из обследуемого водного объекта. При этом следует иметь в виду, что разные виды рыб обладают неодинаковой чувствительностью по отношению к токсикантам. Для биотестирования подходят высокочувствительные и среднечувствительные виды. К высокочувствительным относятся форель – Salmo trutta fario, пескарь – Gobio gobio, плотва – Rutilus rutilus, верховка – Leucaspis delineatus, судак – Stizostedion lucioperca, к среднечувствительным – окунь – Perca fluviatilis, красноперка – Scardinius erithrophthalmus, голавль – Leuciscus cephalus, лещ – Abrarnis brama, гольян – Phoxinus phoxinus, карп – Cuprinus carpio, уклейка – Alburnus alburnus. Набор регистрируемых тест-реакций рыб весьма разнообразен. Наряду с выживаемостью (общим показателем жизнедеятельности) регистрируют различные физиологические, биохимические и поведенческие реакции.

Загрязнение морских вод можно оценивать и с помощью адаптированных к солености воды морских организмов (люминесцирующие бактерии: V.fisheri, P.phosphoreum), хотя их чувствительность к загрязнителям ниже из-за постоянного обитания в среде со сложным химическим составом.

Для морских вод – жаброногих ракообразных Artemia salina L., культуры планктонных водорослей Phaeodactylum tricornutum Bohlin и Sсeletonema costatum. Морские планктонные организмы также могут служить объектами токсикологического контроля. Наиболее удобными в лабораторных исследованиях, а также и весьма чувствительными тест-объектами являются копеподы Acartia clausi Giesbrecht, 1889 (сем.Acartiidae), Oithona minuta Kricz, 1873 (сем.Oithonidae) и кладоцеры Penilia avirostris Dana, 1849 (сем.Sididae). Удобными объектами лабораторного культивирования и токсикологических исследований являются гидроидные полипы (Cordilophora incermanica Marphemin и C. caspia Pallas, 1771 (сем.Clavidae). О токсикологическом воздействии можно судить по росту колоний, количеству гидрантов и другим морфофункциональным показателям. Возможно использование в качестве тест-объекта сцифоидной медузы Aurelia aurita L. с использованием показателя чередования поколений как особенности индивидуального развития (метагенез).

Используется также морской циркумполярный вид коловраток Brachionus plicatilis (Muller) и планктонный вид жаброногих ракообразных Artemia salina. Предличинок длиннорылой камбалы и японского анчоуса на фитотоксичность (тест-объект – семена редьки, Raphanus sativus) и на токсичность (тест-объект – черви Eisenia foetida).

Для биотестирования солоноватых водоемов и предустьевых участков рек удобными объектами являются Moina brachiata Jurine, 1820 (сем.Daphniidae), Diaphonosoma brachyurum Lievin, 1848 (сем.Sididae), Diaptomus salinus Daday, 1885 (сем. Diaptomidae). Показателями токсичности водной среды служат выживаемость и плодовитость ракообразных, причем чувствительность этих объектов, как правило, значительно выше традиционной в биотестировании артемии или альготестов на водорослоях.

Для оценки состояния почв и снеговой воды используются тест-объекты злаки. Считается, что подавление роста и развития растений на 30 и более % свидетельствует о фитотоксичности объекта. Испытано 3 злака: рожь, ячмень, пшеница. Несложность, быстрота, компактность проведенного метода позволяет рассматривать данные культуры как перспективные организмы для разработки гостированных методик для биотестирования применительно к определенному сезону года.

Для оценки токсичности донных осадков и воды используют жаброногого рачка Аrtemia salina и одноклеточную водоросль Phaeodactylum tricornutum.

Регистрируемыми показателями является выживаемость и скорость роста науплиусов А. salina, изменение численности Ph. Tricornutum.

По изучению токсичности сырой нефти используют трубкожилов Microdeutopus grillotalpa A.Costa, 1853 (сем. Aoridae); Corophium bonelli M.-Edwards, 1857 (сем.Corophiidae); Erichtonius difformis M.-Edwards, 1830 (сем.Corophiidae); Jssa ocia Bate, 1862 (сем.Jssidae), а также псаммофильных ракообразных: изопод Eurydice pontica Czerniavsky,1868 (сем. Cirolanidae), кумовых раков Iphinoe moetica Sowinskyi, 1893 (сем.Bototriidae), гарппактикоид Canuella furcigera Sars, 1903 (сем.Canuellidae); амфипод Ampelisca diadema A.Costa, 1853 (сем. Ampeliscidae).

Экспресс-оценка эмбриотоксичности испытуемой водной среды по уровню свободных радикалов у эмбрионов и зародышей лягушек. Объекты исследования: зародыши травяной (Rana temporaria L.) или шпорцевой (Xenopus laevis D.) лягушек, стандартизированные по возрасту.

В России в качестве тест-объекта используют около 5 видов (Lemna minor L., L. trisulca L., L. gibba L., Spirodela polyrrhiza L., Wolffia arrhiza L.). Особенное морфологического строения, высокая скорость размножения, чувствительность к среде обитания – все это сделало ряску удобными объектом для биологического тестирования.

В Голландии различные полезные для человека растения используются в качестве тест-объектов на больших площадях страны: гладиолусы и тюльпаны являются тест-объектами на накопление фторидов; итальянская ржаная трава – тест-объект на накопление ионов тяжелых металлов.

Из табл. 2.4 видно, что искусственно синтезировать среду и корм целиком невозможно. Можно лишь обеспечить некоторую стандартизацию условий. Например, бактерии (часто используемые как первичный корм организмов) разводят на мясопептонном бульоне (МПБ) или студнеобразном агаре (МПА), которые приготавливают из мясной вырезки с добавлением солей и пептона (продукта гидролиза белка). Поэтому составы бульона и агара зависят от качества мяса. Гаметы тоже невозможно получить в полностью контролируемых условиях. Выделение из периферической крови лейкоцитов и искусственная стимуляция их деления не полностью соответствуют естественному механизму размножения кровяных клеток, что затрудняет трактовку мутаций.

Использование организмов для биотестирования

Биотестирование как вид лабораторного биологического контроля проводится только на основании рекомендованных и утвержденных методик с использованием специально выращенных лабораторных организмов. Все процедуры проведения опытов и обработки результатов описываются в международных стандартах ISO (International Organisaton for Standartisation) или в природооохранных нормативных документах (ПНД) РФ, близких по содержанию к ISO (см. табл. 3.4.).

Таблица 3.4. Основные разделы нормативных документов по биотестированию

Назначение и область применения

Scope and field of application

Условия проведения теста *

Метрологические характеристики методики

Interpretation and validity of the results

Средства измерений, посуда, реактивы, материалы, растворы

Reagents and materials. Apparatus

Условия безопасного проведения работ

Требования к квалификации операторов

Условия выполнения измерений

Подготовка к выполнению измерений

Treatment and preparation of samples

Обработка и оформление результатов

Expression of results

Форма представления результата анализа

Приложение А (справочное): характеристика тест-объекта

Annex А,В,С-описание выращивания тест-объекта.

Приложение Б (обязательное): выращивание тест-объекта

Методики измерения реакции, примеры вычислений результатов

Приложение В ( обязательное ) подготовка тест-объекта к анализу

  • * Могут отсутствовать или входить в качестве подраздела.
  • ** Могут определяться дополнительными документами.

Таблицы 2.4., 3.4 содержит перечень организмов, которые рекомендованы различными стандартами биотестирования, для определения качества воды, токсичности полимеров, исследования мутагенности веществ и излучений.

За рубежом стараются применять для экологического контроля организмы, выбор которых был бы понятен не только специалистам, но и присяжным заседателям, так как результаты тестирования могут быть подвергнуты по требованию фирм судебной проверке.

Для контроля необходимо отбирать организмы с учетом следующих требований:

  • 1) хозяйственной и экологической значимости вида;
  • 2) безвредности организма для человека, изученности его возможных форм;
  • 3) чувствительности к загрязнителям окружающей среды.

При биотестировании, как правило, не используются организмы-мутанты, полученные методами генной инженерии. Предпочтение отдается видам, существующим в природе. Используются различные гидробионты – водоросли, микроорганизмы, беспозвоночные, рыбы.

Для биотестирования необходимы организмы, реагирующие на низкие концентрации загрязнителя и способные сохранять хемочувствительность при изменении (в требуемом диапазоне) других факторов окружающей среды, например температуры и кислотности. Как правило, наиболее чутко реагируют на вредные вещества организмы, живущие в пресной и проточной водах. Поэтому в биотестирование применяют пресноводные инфузории P. caudatum, дафнии, радужную форель, аквариумных рыбок вида Brahydanio (обитателей ручьев и представителей промыслового семейства карповых). Контроль реакции водорослей (Chlorella, Scenedesmus) необходим для оценки воздействия загрязнителей на фотосинтез. Водоросли могут также использоваться как стандартизированный корм для дафний и рыб. В некоторых биотестах размножение дафний контролируется косвенным методом – по выеданию ими микроскопических водорослей и, обусловленному этим процессом, изменению цвета культуральной среды.

Бактерии E.coli кишечной микрофлоры желудка человека и ферменты позволяют исследовать воздействие загрязнений водных сред на метаболизм “in vivo” и “in vitro”.

Сперматозоиды крупного рогатого скота теряют свою подвижность при попадании в среду с вытяжками вредных полимеров.

В биотестировании находят все большее распространение одноклеточные организмы. Выращивание больших популяций микроорганизмов, применяемых в биотехнических методах биологического контроля (ряда видов бактерий, грибов или их ферментов), возможно лишь в автоматических культиваторах – ферментерах. Поэтому применение подобных биообъектов предполагает наличие инфраструктуры обеспечения биологического контроля. Простейших можно получать для опытов как методами автоматизированного непропорционально-проточного культивирования, так и в обычной лабораторной посуде (в чашках Петри или пробирках).

Из табл. 2.4 видно, что искусственно синтезировать среду и корм целиком невозможно. Можно лишь обеспечить некоторую стандартизацию условий. Например, бактерии (часто используемые как первичный корм организмов) разводят на мясопептонном бульоне (МПБ) или студнеобразном агаре (МПА), которые приготавливают из мясной вырезки с добавлением солей и пептона (продукта гидролиза белка). Поэтому составы бульона и агара зависят от качества мяса. Гаметы тоже невозможно получить в полностью контролируемых условиях. Выделение из периферической крови лейкоцитов и искусственная стимуляция их деления не полностью соответствуют естественному механизму размножения кровяных клеток, что затрудняет трактовку мутаций.

Ведущее положение в различных областях мониторинга и охраны окружающей среды, в том числе в системе экологического нормирования химических веществ занимают биотестовые методы на дафниях – ветвистоусых ракообразных, относящихся к семейству Daphniidae – Daphnia magna, D. longispina, Ceriodaphnia dubia, Ceriodaphnia affinis. и др.

К достоинствам дафнии, как тест-объектам, относится:

  • – Сравнительная простота культивирования и содержания;
  • – Наглядность функциональных изменений при экстремальных воздействиях и легкость их учета;
  • – Многоклеточная организация, что делает этот объект более адекватным высшим организмам, чем широко используемые культуры одноклеточных организмов;
  • – Сравнительно высокая чувствительность к токсическим воздействиям;
  • – Всесторонняя изученность вида, что позволяет анализировать особенности механизмов действия токсического агента.

При биотестировании на дафниях можно регистрировать различные тест-реакции, но традиционными остаются выживаемость и плодовитость; среди других чаще всего используются поведенческие реакции, морфометрия и окраска тела, скорость выедания корма и др. для токсикологической оценки водной среды.

Среди простейших приоритет принадлежит представителям типа инфузорий (Ciliophora): Tetrachymena pyrifomis (Ehrenberg) Schewiakoff давно и достаточно успешно применяется для оценки токсичности и пищевой ценности продуктов питания человека и животных по снижению прироста количества простейших. Инфузории рода Paramecium, также широко используются в токсикологической практике, наиболее известные виды – Paramecium caudatum, Paramecium putrinum, Paramecium aurelia, Paramecium multinucleus. Позволяют определить по хемотаксической реакции простейших дозозависимые эффекты различных фармакологических препаратов, косметических средств, кормовых и пищевых продуктов.

Stylonychia mytilus (Способ позволяет получить оценку острой токсичности кормов. Метод широко внедрен в сельскохозяйственную практику), Colpoda steinii, Euplotes balteatus, и др.

Инфузории как тест-объекты обладают рядом достоинств:

  • – высокая чувствительность к токсикантам различной природы;
  • – короткий жизненный цикл;
  • – высокая скорость размножения;
  • – сочетание признаков эукариотной клетки и целостного организма;
  • – ярко выраженные таксисы;
  • – простота содержания в лабораторных условиях.

По сравнению с другими группами простейших, инфузории имеют наиболее сложное строение и отличаются разнообразием функций. При разработке и применении биотестов большое значение имеет его стандартизация. Культура инфузорий легко подвергается стабилизации при проточном культивировании, когда скорость роста культуры регулируется скоростью протока среды. При биотестировании на инфузориях о токсичности исследуемой пробы судят по выживаемости, интенсивности размножения, изменению двигательной активности, поведенческим (таксическим) реакциям и др.

Одни из наиболее чувствительных тест-организмов – водоросли. Важность их для биотестирования определяется тем, что, являясь первичными продуцентами, водоросли представляют собой основу пищевых цепей в природных экосистемах. В качестве тест-объектов используют представителей разных отделов водорослей, различные тест-реакции и критерии токсичности. Наиболее часто в качестве тест-организмов используют зеленые водоросли – хлореллу (Chlorella vulgaris Beijer) – изменение оптической плотности зеленых водорослей и сценедесмус (Sctnedesmus quadricauda) – изменение уровня флуоресценции хлорофилла и численности клеток зеленых водорослей.

Токсичность воды оценивается по прекращению фотосинтеза (водоросли обесцвечиваются или приобретают коричневую или желтую окраску), по отмиранию клеток, по изменению формы и окраски хроматофора и другим показателям.

Культуры одноклеточных водорослей находят широкое применение в биотестирование по следующим критериям:

  • · Отработана методика культивирования и использования водорослей для исследовательских задач;
  • · Возможна регистрация тест-реакций разного уровня интегральности – как функциональных (реакций фотосинтеза, так и популяционных, что особенно важно при оценке потенциального экологического ущерба от загрязнения;
  • · Возможно аппаратное оснащение регистрации тест-реакций;
  • · Возможно получение быстрого (минуты) ответа на появление токсического начала в окружающей среде.

Особый интерес представляют биотесты на рыбах в связи с их важностью как высшего звена в трофической цепи водных экосистем. Широко используемой в качестве объекта исследований костистой рыбы – вьюна, Misgurnus fossilis L. Принцип оценки жизнеспособности сперматозоидов по двигательной активности состоит в активации сперматозоидов в среде и регистрации их подвижности с помощью цифровой камеры или на фотопленке.

Существует целый ряд биотестов, основанных на использовании в качестве тест-организмов различных видов рыб. На первом месте среди них стоит методика биотестирования на гуппи – Poecillia reticulate Peters (По гибели).

Этот вид живородящих тропических рыбок, удобный для культивирования и наблюдений, можно отнести к чувствительным по отношению к целому ряду загрязняющих веществ. Для биотестирования природных вод пригодны и другие виды рыб. Допускается использование рыб, отловленных непосредственно из обследуемого водного объекта. При этом следует иметь в виду, что разные виды рыб обладают неодинаковой чувствительностью по отношению к токсикантам. Для биотестирования подходят высокочувствительные и среднечувствительные виды. К высокочувствительным относятся форель – Salmo trutta fario, пескарь – Gobio gobio, плотва – Rutilus rutilus, верховка – Leucaspis delineatus, судак – Stizostedion lucioperca, к среднечувствительным – окунь – Perca fluviatilis, красноперка – Scardinius erithrophthalmus, голавль – Leuciscus cephalus, лещ – Abrarnis brama, гольян – Phoxinus phoxinus, карп – Cuprinus carpio, уклейка – Alburnus alburnus. Набор регистрируемых тест-реакций рыб весьма разнообразен. Наряду с выживаемостью (общим показателем жизнедеятельности) регистрируют различные физиологические, биохимические и поведенческие реакции.

Загрязнение морских вод можно оценивать и с помощью адаптированных к солености воды морских организмов (люминесцирующие бактерии: V.fisheri, P.phosphoreum), хотя их чувствительность к загрязнителям ниже из-за постоянного обитания в среде со сложным химическим составом.

Для морских вод – жаброногих ракообразных Artemia salina L., культуры планктонных водорослей Phaeodactylum tricornutum Bohlin и Sсeletonema costatum. Морские планктонные организмы также могут служить объектами токсикологического контроля. Наиболее удобными в лабораторных исследованиях, а также и весьма чувствительными тест-объектами являются копеподы Acartia clausi Giesbrecht, 1889 (сем.Acartiidae), Oithona minuta Kricz, 1873 (сем.Oithonidae) и кладоцеры Penilia avirostris Dana, 1849 (сем.Sididae). Удобными объектами лабораторного культивирования и токсикологических исследований являются гидроидные полипы (Cordilophora incermanica Marphemin и C. caspia Pallas, 1771 (сем.Clavidae). О токсикологическом воздействии можно судить по росту колоний, количеству гидрантов и другим морфофункциональным показателям. Возможно использование в качестве тест-объекта сцифоидной медузы Aurelia aurita L. с использованием показателя чередования поколений как особенности индивидуального развития (метагенез).

Используется также морской циркумполярный вид коловраток Brachionus plicatilis (Muller) и планктонный вид жаброногих ракообразных Artemia salina. Предличинок длиннорылой камбалы и японского анчоуса на фитотоксичность (тест-объект – семена редьки, Raphanus sativus) и на токсичность (тест-объект – черви Eisenia foetida).

Для биотестирования солоноватых водоемов и предустьевых участков рек удобными объектами являются Moina brachiata Jurine, 1820 (сем.Daphniidae), Diaphonosoma brachyurum Lievin, 1848 (сем.Sididae), Diaptomus salinus Daday, 1885 (сем. Diaptomidae). Показателями токсичности водной среды служат выживаемость и плодовитость ракообразных, причем чувствительность этих объектов, как правило, значительно выше традиционной в биотестировании артемии или альготестов на водорослоях.

Для оценки состояния почв и снеговой воды используются тест-объекты злаки. Считается, что подавление роста и развития растений на 30 и более % свидетельствует о фитотоксичности объекта. Испытано 3 злака: рожь, ячмень, пшеница. Несложность, быстрота, компактность проведенного метода позволяет рассматривать данные культуры как перспективные организмы для разработки гостированных методик для биотестирования применительно к определенному сезону года.

Для оценки токсичности донных осадков и воды используют жаброногого рачка Аrtemia salina и одноклеточную водоросль Phaeodactylum tricornutum.

Регистрируемыми показателями является выживаемость и скорость роста науплиусов А. salina, изменение численности Ph. Tricornutum.

По изучению токсичности сырой нефти используют трубкожилов Microdeutopus grillotalpa A.Costa, 1853 (сем. Aoridae); Corophium bonelli M.-Edwards, 1857 (сем.Corophiidae); Erichtonius difformis M.-Edwards, 1830 (сем.Corophiidae); Jssa ocia Bate, 1862 (сем.Jssidae), а также псаммофильных ракообразных: изопод Eurydice pontica Czerniavsky,1868 (сем. Cirolanidae), кумовых раков Iphinoe moetica Sowinskyi, 1893 (сем.Bototriidae), гарппактикоид Canuella furcigera Sars, 1903 (сем.Canuellidae); амфипод Ampelisca diadema A.Costa, 1853 (сем. Ampeliscidae).

Экспресс-оценка эмбриотоксичности испытуемой водной среды по уровню свободных радикалов у эмбрионов и зародышей лягушек. Объекты исследования: зародыши травяной (Rana temporaria L.) или шпорцевой (Xenopus laevis D.) лягушек, стандартизированные по возрасту.

В России в качестве тест-объекта используют около 5 видов (Lemna minor L., L. trisulca L., L. gibba L., Spirodela polyrrhiza L., Wolffia arrhiza L.). Особенное морфологического строения, высокая скорость размножения, чувствительность к среде обитания – все это сделало ряску удобными объектом для биологического тестирования.

В Голландии различные полезные для человека растения используются в качестве тест-объектов на больших площадях страны: гладиолусы и тюльпаны являются тест-объектами на накопление фторидов; итальянская ржаная трава – тест-объект на накопление ионов тяжелых металлов.

Биотестирование как вид лабораторного биологического контроля проводится только на основании рекомендованных и утвержденных методик с использованием специально выращенных лабораторных организмов. Все процедуры проведения опытов и обработки результатов описываются в международных стандартах ISO (International Organisaton for Standartisation) или в природооохранных нормативных документах (ПНД) РФ, близких по содержанию к ISO (см. табл. 3.4.).

Лабораторная работа № 23. БИОТЕСТИРОВАНИЕЗАГРЯЗНЕНИЯ ВОДЫ С ПОМОЩЬЮ РЯСКИ МАЛОЙ(iLEMNA MINOR L.) (Методика разработана Л. В. Цаценко)

Представители семейства рясковых являются самыми маленькими цветковыми растениями в мире. В результате гидрофильной эволюции они достигли крайней степени редукции всех органов, поэтому по простоте строения занимают первое место среди цветковых растений.

Вегетативное тело рясковых называется листецом. Листецы одиночные или собраны в небольшие группы с помощью гиалиновой нити — тонкого выроста мембраны. Листецы состоят из паренхимных клеток хлоренхимы, разделенных большими межклеточными полостями, заполненными воздухом. Проводящая система неразвита. Корни развиты слабо и не достают грунта, по строению простые, одинарные (у многокоренника их число составляет от 3 до 10), отходят от брюшной поверхности листеца, зеленые, поскольку содержат хлорофилл. Рясковые — растения космополиты, распространены по всему свету. Вегетативное тело по виду напоминает крошечный плавающий лист или слоевище низших растений, поэтому длительное время их считали водорослями.

Листецы рясковых либо одиночные, либо соединены в небольшие группы. Форма листецов может быть почковидной или шаровидной. Цветение у рясок наблюдается крайне редко. Плоды хорошо видны невооруженным глазом, они чуть больше макового зернышка.

Ряску называют «экологической дрозофилой». Особенности морфологического строения, высокая скорость размножения, чувствительность к среде обитания — все это сделало ряску удобным

объектом для биологического тестирования. Семейство рясковых содержит более 40 видов, из них в России обитает только 5 видов (Lemna minor L., L. trisulca L., L. gibba L., Spirodela polyrrhiza L., Wolffia arrhiza L.).

Ряска малая (Lemna minor L.) — растение, плавающее на воде. Размер листецов (см. справочный материал к лабораторной работе № 23) 2 — 4 мм. Число жилок 3 (рис. 23.1). Листецы плоские, образуют группы из 3 — 6 растений.

Рясковые размножаются преимущественно вегетативно, отдельный лист может пройти 10 делений за период 7—10 сут. Рясковые могут удваивать свою массу за время от 10 ч до 2 сут при оптимальных температуре, освещении и питании.

Принцип предложенного в данной лабораторной работе метода основан на определении гибели и изменений в темпах роста ряски малой, учете морфологических изменений (хлороз, некроз поверхности листеца, расслоение листецов) при воздействии токсических веществ в исследуемой среде по сравнению с контролем.

Острое токсическое действие исследуемой воды на ряску определяется по гибели ее за определенный период времени. Критерием острой токсичности служит гибель 50 % и более растений за 96 ч в исследуемой воде при условии, что в контроле погибло не менее 10 % растений.

Рис. 23.1. Строение ряски малой (Lemna minor L.):

А — общий вид; Б — группа листецов (один материнский и два дочерних); В — растение ряски в начале эксперимента; Г — растения ряски в конце эксперимента

В экспериментах по определению острого токсического действия устанавливают: среднюю летальную концентрацию отдельных веществ (кратность разбавления вод, содержащих смеси веществ), вызывающую гибель 50 % и более тест-организмов; безвредную (не вызывающую эффекта острой токсичности) концентрацию отдельных веществ (кратность разбавления вод, содержащих смеси веществ), вызывающую гибель не более 10 % тест-организмов.

Хроническое токсическое действие исследуемой воды на ряску малую оценивают по смертности и скорости роста за период до 24 сут в исследуемой воде по сравнению с контролем. Критерием хронической токсичности служит гибель 20 % и более тест-организмов и (или) достоверное отклонение в скорости роста из числа выживших растений по сравнению с контролем.

Биотестирование проводится в лабораторных условиях. Помещение не должно содержать токсичных паров и газов. Температура окружающего воздуха в лаборатории от + 18 до + 25 °С. Атмосферное давление 84—106 кПа (630—800 мм рт.ст.). Освещение помещения естественное или искусственное, не ограничено особыми требованиями. Освещенность для ряски 2 500 — 3 500 лк. Интенсивность света должна быть более чем на 15 % больше по сравнению с дневным светом.

Предварительная подготовка к отбору проб и выполнению биотестирования включает подготовку посуды, пробоотборников, мест хранения отобранных проб, а также подготовку рабочего места для обработки доставленных в лабораторию проб и исследования их на токсичность. Все процедуры предварительной подготовки должны исключить попадание токсичных, органических и каких- либо других веществ в исследуемую воду.

Посуда для отбора проб и биотестирования должна быть химически чистой. Она промывается смесью бихромата калия и серной кислоты (хромовой смесью). Стенки посуды осторожно смачиваются хромовой смесью и через 2—3 ч посуда тщательно промывается водопроводной водой, нейтрализуется раствором пищевой соды и промывается 3 — 4 раза дистиллированной водой. Для мытья посуды не разрешается пользоваться синтетическими поверхностно-активными веществами и органическими растворителями. Посуду для отбора проб сушат на воздухе, а используемую для биотестирования, за исключением мерной, — в сушильном шкафу при 160СС в течение 1 ч.

Химически чистая посуда для биотестирования должна храниться с закрытыми стеклянными притертыми пробками или завинчивающимися крышками в защищенных от пыли ящиках лабораторного стола или на закрытых полках, стеллажах и т. п. Вся грязная посуда после проведения анализов должна подвергаться стерилизации кипячением в течение 1 ч.

Культивационная вода используется для разведения маточной культуры, в качестве контрольной с добавлением питательного раствора для биотестирования, для разбавления исследуемых вод. Для подготовки культивационной воды питьевую воду отстаивают в течение 3 — 7 сут (до полного дехлорирования) в бутыли из бесцветного стекла. При отсутствии питьевой воды удовлетворительного качества допускается использование поверхностной пресной или грунтовой воды, отобранной вне зоны влияния источников загрязнения и профильтрованной через фильтр с размером пор 3,5 мкм.

В культивационной воде должны отсутствовать органические загрязняющие вещества, хлор, токсические вещества и антагонистические для ряски организмы (синезеленые водоросли, простейшие, многоклеточные); pH быть в пределах 4,5 —7,0, температура (20 + 5) °С.

Прежде “чем приступить к биотестированию на представителях семейства рясковых, ознакомьтесь с терминами и понятиями, применяемыми в данной лабораторной работе, которые приведены в справочном материале.

Оборудование, материалы и растворы:

флуоресцентный свет или свет дневной лампы для роста ряски (полное освещение в течение 16 ч); стерильная культура растений ряски; 21 чистый пластиковый контейнер; среда для культивирования — ростовой раствор (табл. 23.1); пипетка для добавления ростового раствора; пинцет для отлова ряски; чистая пластиковая пленка или пластиковая пластинка; 100 мл тестируемого раствора в концентрации 4 ПДК (табл. 23.2); дистиллированная вода для контрольного варианта.

ПОРЯДОК ВЫПОЛНЕНИЯ ЛАБОРАТОРНОЙ РАБОТЫ

В тестировании использовали 5-дневный цикл развития растений. Подготовить посуду для контроля и с указанными концентрациями испытуемого вещества. Налить 30 мл раствора в каждый контейнер. В контрольный вариант влить родниковую или отстоянную водопроводную воду и добавить одну каплю раствора для культивирования. Используя пинцет, перенести в каждый контейнер по 5 растений рясок. Выбирать только зеленые, здоровые растения с 2 дочерними листецами и приблизительно одинаковых размеров. Закрыть контейнеры пленкой и поместить на 24 ч под лампу дневного света. Размещения контейнеров под прямыми солнечными лучами у окна следует избегать, чтобы предотвратить перегрев и усыхание листецов (они сжимаются, теряют тургор).

Представители семейства рясковых являются самыми маленькими цветковыми растениями в мире. В результате гидрофильной эволюции они достигли крайней степени редукции всех органов, поэтому по простоте строения занимают первое место среди цветковых растений.

Методы биотестирования

Методы биотестирования

Специальность 020201.65 Биология

1 Биотестирование 4

2 Тест-объекты биотестирования 6

3 Тест-реакция 11

Список литературы 14

В настоящее время одним из наиболее широко применяемых методов контроля токсичности загрязнения окружающей среды является биотестирование. Этот метод основан на контроле у лабораторно-полученного биообъекта наиболее чувствительного к определенным классам загрязнителям – тест-объекта аппаратурно регистрируемой или количественно измеряемой реакции – тест-реакции [1]. В настоящее время, имеется значительный опыт применения самых различных биологических объектов для определения степени загрязнения окружающей среды. Микроорганизмы наиболее удобны в качестве тест-объекта в виду возможности их культивирования в стандартных условиях и популяционной реакции, обеспечивающую статистическую достоверность исследования токсикантов. При этом тест-объект должен быть хорошо изученным [1]. В последнее время наиболее перспективными организмами для индикации считаются микроорганизмы. Они обладают высокой чувствительностью, высокой скоростью размножения, простотой культивирования и используются в приборах и системах, предназначенных для быстрой и точной оценки состояния окружающей среды

1 БИОТЕСТИРОВАНИЕ

Биотестирование – вид биологического контроля объектов окружающей среды, основанный на измерении тест-реакции тест-организма к вредному фактору, предполагающий проведения лабораторных экспериментов с живым существами. Тест-организм – специально выращенный в контролируемых условиях организм, наиболее чувствительный для данного вида биологического контроля. Тест-реакция – количественно измеряемое изменение физико-химических свойств организмов (популяций) при воздействии вредного фактора. Любой биологический эксперимент должен проводиться при соблюдении следующих принципов:

1 постоянство условий;

2 многократной повторяемости (при сохранении результатов);

4 .наличия описания, позволяющего специалисту воспроизвести эксперимент (при этом его результат должен сохраняться).

Эти принципы необходимо соблюдать при лабораторных опытах, натурных наблюдений и проектировании аппаратуры. По длительности воздействия вредных веществ на организмы различают: тесты на выявления токсичности острой (длительность менее 96 ч) и хронической (более96 ч). В последних тестах учитывается эффект адаптации живых организмов к вредным факторам. При тестировании качества биоцидных товаров часто применяют тест-организмы, относящиеся к разным типам биотических элементов экосистемы. В современных биотестах прослеживается переход от модельных организмов к модельным экосистемам, которые по степени глобальности делятся на макрокосмы (например, отгороженные участки моря), мезокосмы (как правило, почвенные сообщества) и микрокосмы (несколько взаимосвязанных видов организмов низших уровней). Такой подход позволяет моделировать сложные ситуации и строить прогнозы их разрешения высокой достоверностью. С другой стороны, контроль состояния модельных экосистем требует применения комплекса технических средств, способных оперативно отслеживать динамику показателей состояния, что представляет собой достаточно сложную проблему. Для уменьшения влияния биологической изменчивости при проведении биотестирования, опыты проводят с большими группами генетически одинаковых организмов, выращенных в стандартных условиях. Это необходимо для выявления статистически значимых различий между реакциями на контрольную и опытную среду. Следует учесть, что живые организмы очень чувствительны к веществам, содержащимся не только в воде, но и в воздухе. Окружающая среда лаборатории не должна содержать вредных веществ. Опыты должны приводиться при определенной температуре и влажности. В частности, следует обратить особое внимание на:

    летучие вещества примышленного (пары кислот, соединения тяжелых металлов, летучие углеводороды), сельскохозяйственного (антибиотики, пестициды, токсины плесеней), бытового и санитарно-гигиенического (инсектициды, дезинфицирующие вещества) происхождения; наличие ультрафиолетовых ламп или излучения с ультрафиолетовой составляющей спектра.

Биотестирование основано на достижениях биотехнологии. Биотехнологией называется промышленное использование биологических процессов на основе получения высокоэффективных форм микроорганизмов. Культур клеток, тканей растений и животных с заданными свойствами. Для биотестирования необходимы организмы, реагирующие на низкие концентрации загрязнителя и способные сохранять хемочувствительность при изменении (в требуемом диапазоне) других факторов окружающей среды, например температуры и кислотности. Как правило, наиболее чутко реагируют на вредные вещества организмы, живущие в пресной и проточной водах.

Выбранная тест-культура должна соответствовать следующим формам:

    биологическая значимость – тест-объект должен быть типичным представителем природной экосистемы; абсолютная безвредность используемого микроорганизма; хорошая изученность биохимии, физиология микроорганизма; высокая чувствительность к исследуемой группе веществ; доступность культивирования для любой практической лаборатории; низкая стоимость получения.

Следует учитывать, что многие внешне похожие микроорганизмы могут обладать разной чувствительностью к вредным веществам и требовать разных условий содержания. Поэтому вид требуется правильно определить по характерным признакам (идентифицировать), определение может быть визуальным или с помощью аппаратурных средств.
Для выращивания любого организма необходимо соблюдать следующие правила: 1. регулярно проводить подкормку

2. удалять продукты жизнедеятельность, Так как согласно , организмы не могут развиваться в среде своих отходов. Измерительный преобразователь Тест-реакция Тест-объект Проба Рисунок 1.Схема биотестовой методики

3. Тест объекты

Вид организма, для которого известны методы идентификации. Методики выращивания и биофизические свойства, называется штаммом.
Выращивание тест-объектов включает следующие стадии:
отбор штамма генетически чистого вида;

    размножение при дозированном стандартном кормлении; очистку от побочных продуктов.

Бактерии являются удобным тест-объектом по следующим причинам:
многочисленность популяции бактерий (от 10 в 9 степени клеток в 1 мл) повышает статистическую достоверность получаемых результатов;

    бактерии являются элементом любой экосистемы; на популяции бактерий можно проследить влияние вредного фактора на нескольких поколениях за очень короткий срок; благодаря небольшим размерам клеток (единицы микрометров) микробная популяция имеет большую поверхность контакта с окружающей средой.

Генетическая информация бактерий заключается в капсулах с ДНК и рассеяна по всей цитоплазме. Поэтому их относят к прокариотам. Питание и выращивание продуктов обмена у бактерий происходит через полупроницаемую оболочку клетки. Бактерии выращивают на питательных бульонах, содержащих полный набор микроэлементов и аминокислот. К наиболее распространенной питательной бактериальной среде относится ГРМ-бульон. Производимый из гидролизата рыбной мукиБактерии выращивают для получения ферментов, фармацевтических препаратов, добавок в молочные биопрдукты. Бактерии обладают высокой скоростью размножения – популяция при благоприятных условиях удваивается каждые 30 мин. Поэтому большое значение при их выращивании имеет стерильность выращивания, при которой не допускается попадания в питательную среду других видов бактерий. Бактерии – тип микроскопических, в большинстве одноклеточных, организмов, обладающих клеточной стенкой. У бактерий есть примитивное ядро, лишенное заметных хромосом и оболочки. Есть бактерии, содержащие зеленый пигмент-хлорофилл. Большинство бактерий имеют палочковидную или круглую форму. Впервые бактерии увидел голландский натуралист А. Левенгук (1683) через свой микроскоп. Одни и те же виды бактерий можно найти почти повсеместно, на всех матерках. В 1 г почвы содержатся сотни тысяч или миллионы бактерий, в 1 мл воды-десятки или сотни. Бактерии активно участвуют в круговороте веществ в природе. Среди этих организмов немало болезнетворных, вызывающих болезни у человека, животных и растений. В состав клеток бактерий входят те же элементы и микроэлементы, что и в состав клеток высших растений и животных. Для жизнедеятельности бактериям нужны азот, минеральные соли, углерод, витамины. Некоторые бактерии способны усваивать азот из атмосферы. К таким азотфиксирующим микроорганизмам относятся азотобактер, клубеньковые бактерии, которые используются для изготовления бактериальных удобрений. [2] Некоторые из бактерий используются в пищевой промышленности (например, для приготовления молочнокислых продуктов), в медицине для восстановления нормальной микрофлоры толстой кишки путем применения препаратов, содержащих лиофильно высушенные бактериальные клетки и бактериальные споры (бифидобактерии, лактобактерии, кишечные палочки), а также в биотехнологии для получения биологически активных соединений. Наибольшее распространение имеют сапрофитные бактерии. Они питаются мертвыми органическими остатками, участвуют в минерализации органических веществ — аммонификации, нитрификации, а также в фиксации азота (клостридии, азотобактеры, микобактерии, сине-зеленые водоросли и др.). Сапрофиты участвуют в круговороте углерода, кислорода, азота, фосфора, серы, железа, некоторые из них расщепляют целлюлозу, кератин, окисляют и образуют углеводороды — метан, пропан и др. Ставится вопрос о применении некоторых сапрофитов для очистки сточных вод, разрушения (биодеградации) различных отходов. Широкое применение находят сапрофиты в биотехнологии для получения различных биологически активных соединений (интерферонов, интерлейкинов, инсулина и др.).Относительно небольшую часть бактерий разделяют на патогенные и условно-патогенные. Патогенные бактерии являются возбудителями инфекционных болезней человека и животных. Условно-патогенными микроорганизмами являются представители нормальной микрофлоры человека. При ослаблении резистентности организма условно-патогенные бактерии вызывают гнойно-воспалительные процессы. Часто в качестве тест-объекта используют инфузории Paramecium caudatum. Инфузории Paramecium caudatum представляют царство животных, но обладают микроскопическими размерами и построены в виде одной клетки. Несмотря на простоту организации, сочетают в себе признаки отдельной клетки и целостного организма.[4] Инфузории по своим биохимическим параметрам очень близки к высшим животным и человеку, что делает возможной экстраполяцию данных, полученных в биотестировании c инфузориями на человека [3]. Они во многих случаях оказываются значительно чувствительнее, чем традиционно используемые лабораторные животные. [4]. Строение P. caudatum показано на рис. 1.Туфелька — обитатель стоячих водоемов с большим количеством разлагающегося органического материала[5]. Paramecium caudatum имеет постоянную удлиненную форму с тупым передним и заостренным задним концами (рис.2.1.1). Размеры инфузории — 200х40 мкм.[6] Вся клетка покрыта тонкой и гибкой ячеистой пелликулой. Реснички покрывают всю поверхность туфельки, располагаясь продольными диагональными рядами. Оптимальная температура для данной инфузории 30 – 32°C. Лучшее значение pH среды 6.3-7.5.[7] Рисунок:2.1.11- рот; 2-глотка; 3,10- вакуоли; 4-порошица; 7, 8-сократительные вакуоли; 9-реснички. Размножаются инфузории 2-3раза в сутки. Преимущества Paramecium caudatum в качестве тест-объекта следующее: неприхотлива в культивировании; сочетает в себе как черты сильно усложненной клетки, так и особенности самостоятельного организма со сложными формами поведения, по чувствительности к ядрам не уступает, а часто и превосходит другие тест-объекты.

Инфузории выращиваются в нестерильных условиях при комнатной температуре в посуде из химического стекла, например в стеклянных колбах, стаканах, чашках Петри и других. В качестве корма используют бактерии, дрожжи и их смесь, выращенные стерильно на твердых средах. При отсутствии условий для выращивания стерильного корма, можно использовать воздушносухие пекарские дрожжи. К общим положениям по выращиванию культуры относится обязательное требование идентичности среды выращивания и среды, которая будет использована для процедур отмывания культуры от продуктов метаболизма, получения рабочей взвеси, разведения водных проб и прочих процедур с культурой. Микроорганизмы культивируются на среде Лозина-Лозинского, для приготовления которой используются дистиллированная вода, набор солей: NaCl, KCl, CaCl2, MgSO4, NaHCO3. Культуру отмывают от продуктов метаболизма и старого корма, добавляют сухие дрожжи в количестве 50 мг на 50 мл и помещают в чашку Петри. Для поддержания культуры отмывание и кормление осуществляется 1 раз в неделю. При отмывании используют нормальную физиологическую реакцию инфузорий собираться в верхних слоях жидкости. Использование сосудов с узким длинным горлом позволяет сконцентрировать инфузории в верхней зоне и слить их в другой сосуд с минимальным количеством загрязненной культуральной среды. Концентрат разбавляют чистой средой Лозина -Лозинского до объема 50 мл. Определение концентрации взвеси инфузорий Концентрацию клеток необходимо контролировать в процессе выращивания культуры, при подготовке рабочей взвеси клеток и для определения величины тест-реакции. Исходную взвесь инфузорий взболтать, отобрать с помощью пипетки 1.0см3 взвеси. К этому объему добавить 9,0см3 1%-ного раствора NaCl. Таким путем достигается обездвиживание инфузорий. Не дожидаясь полного обездвиживания инфузорий(примерно через 2-5 мин) из разбавленной взвеси отбирают 0,5-1,0см3 и распределяют этот объем в виде 6-10 крупных капель на сухом стекле(например, в чашке Петри).С помощью микроскопа(лупы)подсчитывают инфузории во всех каплях. Полученный результат пересчитывают на 1см3 исходной взвеси.

4 ТЕСТ-РЕАКЦИЯ

Тест-реакция биологического объекта, пригодного для проведения биотестирования, должна обладать следующими свойствами:
непродолжительностью протекания;

1 адекватностью – сопоставимостью по механизму воздействия с реакцией на это же вещество – высших животных и человека;

2 существованием количественной зависимости между реакцией микроорганизма и степенью биологической вредности среды.

Рост-размножение является наиболее освоенной экотоксикологами тест-реакцией на вредные вещества в среде. С биологической точки зрения рост можно определить как необратимое увеличение сухой массы протоплазмы и белка, на которое влияет множество как внутренних, так и внешних факторов. Для роста популяции микроорганизмы должны потреблять питательные вещества. Питательная среда для растений и микроорганизмов называется субстратом. Потребление одноклеточными организмами субстрата приводит к росту популяции. При размножении микроорганизмов на жидких питательных средах увеличивается их мутность. Степе мутности оценивается либо визуально в баллах, либо методами оптического контроля.

Измерения тест-реакции подавления размножения бактерий чаще всего проводят фотоколориметрическими определением оптической плотности бактериальной популяции через сутки после ее помещения в чистую и загрязненную питательную среду. Существенным недостатком биотеста является его длительность и, как следствие, невозможность использования в качестве экспресс-метода. В качестве тест-реакции тест-объекта целесообразно использовать различные виды таксисов, т. е. направленные перемещения популяции организмов под действием внешних факторов. Для возникновения таксиса необходимо создание его градиента, т. е. неоднородности распределения в пространстве. Это позволяет организмам определять направление движения от меньшего значения внешнего фактора к большему или наоборот.

При помощи, биотестирования на простейших можно использовать для оценки имунно-физиологического состояния различных водных организмов в водоемах разного трофического статуса, (т. е. кол-во биомассы водоемов), загрязнения водоемов от различных хозяйственных стоков, а также влияние антропогенных факторов. В целом можно предугадать состояние водоемов. А так же биотестирование используется как метод оценки токсичности водной среды: при проведении токсикологической оценки промышленных, сточных бытовых, сельскохозяйственных, дренажных, загрязненных природных и проточных вод с целью выявления потенциальных источников загрязнения,

· в контроле аварийных сбросов высокотоксичных сточных вод,

· при проведении оценки степени токсичности сточных вод на разных стадиях формирования при проектировании локальных очистных сооружений,

· в контроле токсичности сточных вод, подаваемых на очистные сооружения биологического типа с целью предупреждения проникновения опасных веществ для биоценозов активного ила,

· при определении уровня безопасного разбавления сточных вод для гидробионтов с целью учета результатов биотестирования при корректировке и установлении предельно допустимых сбросов веществ, поступающих в водоемы со сточными водами,

· при проведении экологической экспертизы новых материалов, технологий очистки, проектов очистных сооружений.

Это всё подтверждает, что биотестирование в последнее время становится все актуальнее.

Список литературы:

1 Лебедева . – М.: «Медицина», 1969, 198,392 с

2 Езепчук как функция биомолекул, М., 1985, библиогр.; Методы общей бактериологии, под ред. Ф. Герхардта и др.,пер. с англ., т. 1—3, М., 1983—1984; Шлегель Г. Общая микробиология, пер. с нем., М., 1987.

3 равнительная физиология животных, т.3.Пер. с англ.-М.:Мир,1978,324-346с.

4 Тумаков методы анализа//Журнал аналитической химии.-1988.-43,№1.-с.20-36. .

5 Жизнь животных: в 6 томах. – М.:”Просвещение”,1968.-Т.1.-576с.

6 Никольский электромагнитного поля. – М.:”Высшая школа”,1964.-383с. ж. Основы культивирования микроорганизмов и клеток.-М.:Мир,1978.-420с.

Виноходов исследования кормов с использование инфузорий.

В настоящее время одним из наиболее широко применяемых методов контроля токсичности загрязнения окружающей среды является биотестирование. Этот метод основан на контроле у лабораторно-полученного биообъекта наиболее чувствительного к определенным классам загрязнителям – тест-объекта аппаратурно регистрируемой или количественно измеряемой реакции – тест-реакции [1]. В настоящее время, имеется значительный опыт применения самых различных биологических объектов для определения степени загрязнения окружающей среды. Микроорганизмы наиболее удобны в качестве тест-объекта в виду возможности их культивирования в стандартных условиях и популяционной реакции, обеспечивающую статистическую достоверность исследования токсикантов. При этом тест-объект должен быть хорошо изученным [1]. В последнее время наиболее перспективными организмами для индикации считаются микроорганизмы. Они обладают высокой чувствительностью, высокой скоростью размножения, простотой культивирования и используются в приборах и системах, предназначенных для быстрой и точной оценки состояния окружающей среды

Биотестирование воды в домашних условиях,

Проблема качества питьевой воды остается актуальной, особенно в крупных и промышленных городах. Она важна для города Белгорода в связи с наличием высокого содержания солей в водопроводной воде. Для потребителя такой воды наличие накипи на стенках бытовых приборов, труб , на нагревательных элементах электрических чайников, стиральных и посудомоечных машин и т.п., а также информации в средствах СМИ о влиянии жесткой воды на состояние и функционирование выделительной и пищеварительной системы, служит указателем на то, что данную воду использовать нежела тельно. Поэтому люди, задумывающиеся о своем здоровье, стараются использовать для своих нужд фильтры для очистки водопроводной воды, а главное – найти воду более чистую . В качестве такой воды рассматривается бутилированная минеральная вода, природные источники, вода артезианских скважин либо привозимая в город на розлив.

Однако, если бутилированная вода проходит санитарно-эпидемиологический контроль (авторы не исключают наличия подделок), то использование воды артезианских скважин, природных источников и тем более «бочковой», вызывает вопрос о потенциальной опасности либо безопасности объекта. Традиционная система контроля качества вод, основанная на аналитических методах, не учитывающих некоторые микропримеси, не всегда отражает реальное влияние данного химического состава на живые организмы. Кроме того, иногда нельзя вовремя и быстро получить информацию о качестве питьевой воды в собственном ключе. Поэтому все популярнее становятся независимые исследования и методика биотестирования. В качестве первоочередного тест-объекта при выявлении потенциально опасных источников загрязнения пресноводных водоемов токсическими веществами приемлемо использовать крупных ветвистоусых раков дафний (Daphnia magna Straus). Этот тест-объект был применен для анализа минеральной бутилированной воды, распространяемой через торговую сеть белгородской области.

Предварительно, для выявления предпочитаемых видов воды, частоты и временных параметров ее употребления, проведено анкетирование среди студентов первого курса дневного отделения БУПК и БелГУ (всего 57 человек, возрастной интервал 16 – 20 лет, преимущественно лица женского пола). Установлено, что минеральная вода основной массой респондентов применяется, главным образом, как столовый напиток (82,5%), с лечебной целью (14%), а для приготовления блюд используется крайне редко (3,5%). Безусловный приоритет (64,4%) принадлежит «Майской хрустальной»; остальные варианты: «Благодатный источник», «Хрусталь Белогорья», «Ессентуки», «Липецкая», «Эдельвейс» – встречались в ответах значительно реже. Повторяемость употребления колеблется, в среднем, от ежедневного (45,6%), еженедельного (22,8%), ежемесячного (8,8%), до «практически никогда» (10,5%). Значительная частота потребления, при условии недостаточной экологической чистоты воды, может привести к проблемам со здоровьем. Отметим попутно, что первенствующее значение у потребителей, безусловно, принадлежит вкусу напитка (35,8% респондентов). Экологическая чистота занимает второе место (21%), цена же располагается только на третьем (15,8%).

Поэтому «Майская хрустальная», «Хрусталь Белогорья», «Благодатный источник», наиболее популярные среди белгородцев, были подвергнуты биотестированию, в процессе которого установлено, что лучшие показатели принадлежат «Майской хрустальной»: плодовитость и количество выживших самок максимальны. «Хрусталь Белогорья» и «Благодатный источник», однако, несколько понижают плодовитость самок (2,2 и 1,5 особи против 5,4 в контроле). Таким образом, биотестирование позволяет выбрать из минеральных вод, близких по химическому составу, жесткости, рН, органолептическим данным те, которые для человека наиболее благоприятны. Приятно отметить, что высший рейтинг у молодежи получила «Майская хрустальная», оказавшаяся экологически безопасной.

Исследования показывают, что метод биоиндикации следует использовать не только в деятельности профессиональных, но и независимых лабораторий, вузовских и школьных экспериментах. Именно школы могут выступать опорной базой для оценки экологической безопасности и качества питьевых источников, расположенных в сельской местности, пробуренных на дачных участках артезианских скважин, особенно в местах массового неорганизованного забора воды населением.

Использование этого незатруднительного метода требует, во-первых, предварительной адаптации дафний (Daphnia magna или другого их вида) к питьевой воде, применяемой в качестве контрольной пробы. Широко встречающийся вид, известный населению России как «водяная блоха», доступен для приобретения любым учителем, что позволяет применять его в школьных исследованиях. Во-вторых, необходимо использование определенных кормов (одноклеточных водорослей), разводить которых помогут школьники. В-третьих, следует предусмотреть наличие определенных площадей, на которых размещаются пробы. В-четвертых, для более компетентного заключения необходимы длительное, двухмесячное, наблюдение и тщательный подсчет числа дафний. Сокращенный вариант метода может служить способом оценки качества воды природного водоема в процессе полевой практики, занятиях экологических кружков, лабораторных исследованиях по экологии и некоторым другим дисциплинам.

Следует рекомендовать метод биондикации с помощью дафний для проведения экологического мониторинга за состоянием природных водных ресурсов и рыбохозяйственных водоемов силами студентов, школьников и заинтересованного населения области. Это позволит использовать данные по изменению степени загрязнения водоемов сточными водами промышленных, сельскохозяйственных, коммунальных предприятий, ливневыми стоками, в практической деятельности педагогов и экологических лабораторий.

Рассматриваемый метод может использоваться в процессе работы над экологическими проектами, к примеру, «Родники моего города». Привлечение учащихся к собиранию материала, адаптации и разведению дафний, подсчету особей, особенно наблюдения в процессе проведения опыта, усиливают заинтересованность в изучении биоэкологии, с другой стороны, вооружают простейшими навыками организации, проведения и анализа результатов элементарных экспериментов, с третьей, позволяют оценить практическую значимость проводимых исследований, способствуют выработке чувства ответственности за полученное дело.

Таким образом, биотестирование, используемое педагогами, оказывает существенное воздействие на процесс развития экологического сознания вследствие наглядного представления влияния деятельности человека на водоемы, изменение качества питьевой воды от малейших микропримесей, воспитанию бережного отношения к источникам.

Работа представлена на III научную конференцию с международным участием «Современное естественнонаучное образование», 1-8 октября 2006г., Лутраки (Греция). Поступила в редакцию 16.09.2006г.

Таким образом, биотестирование, используемое педагогами, оказывает существенное воздействие на процесс развития экологического сознания вследствие наглядного представления влияния деятельности человека на водоемы, изменение качества питьевой воды от малейших микропримесей, воспитанию бережного отношения к источникам.

Работа 4. Биотестирование с использованием рыб

(Лабораторная работа подготовлена Е.И. Егоровой)

Принцип метода основан на сравнении выживаемости рыб в воде, содержащей токсические вещества, и в водопроводной воде.

Кратковременное биотестирование (до 96 ч) позволяет определить острое токсическое действие воды на рыб по их выживаемости. Показателем выживаемости служит среднее количество тест-объектов, выживших в тестируемой воде или контроле за определённое время. Критерием токсичности является гибель 50% и более рыб за период до 96 ч в тестируемой воде по сравнению с контролем.

Длительное биотестированис (до 30 суток) позволяет определить хроническое токсическое действие воды на рыб по их выживаемости.

Для успешного проведения анализа следует выполнять ряд требований по содержанию тест-объектов и условиям биотестирования:

  • • использовать термостатируемые аквариумы, обеспечивающие плотность посадки рыб из расчёта 1-2 л воды на 1 экз., производителей — 4 л на 1 экз. (для гуппи) и не более одного на 3,5 л (для данио);
  • • размещать аквариумы в помещениях, не содержащих токсичных паров или газов; заполнять водопроводной водой (Т-24 — 27°С), отстоянной трое суток. Поддерживать первоначальный объём воды. Менять 1/5 воды еженедельно;
  • • содержать в аквариуме мелколиственные и плавающие растения. Аквариум освещать дневным светом не менее 8 ч в сутки для гуппи, для данио достаточно естественной смены дня и ночи;
  • • кормить тест-объекты 1-2 раза в сутки, производителей —
  • 3-5 раз сухим (дафнии, циклопы) или живым (мотыль, трубочник, дафнии, циклопы) кормом. Необходим дополнительно растительный корм (водоросли, листья аквариумных растений, салат и т.д.);
  • • используют для биотестирования гуппи в возрасте 1-3 недели и половозрелых данио;
  • • биотестирование проводить при естественной смене дня и ночи, концентрация кислорода в воде должна быть не менее 4 мг/л;
  • • в аквариумы налить по 10 л тестируемой и контрольной воды. Повторность двукратная. Проводить аэрацию компрессором, воду менять через двое суток. Рыб переносить при помощи сачка. Ежесуточно подсчитывать выживших и удалять умерших рыб. При кратковременном биотестировании рыб не кормить.

Цель работы: оценка токсического действия воды, содержащей хлорорганические пестициды.

Оборудование, материалы и реактивы: аквариумы объёмом 200, 50 и 10 л, микрокомпрессоры; рыбы — гуппи и данио; сачки, корм для рыб; 50 мл исходного раствора пестицида (например, гек- сохлоран, симазин, 2,4D) в концентрации 10′ 3 ’10’ 4 (0,001-0,0001 %) в 2%-ной сахарозе.

1. Приготовить растворы пестицида в концентрациях 0,1; 1 и 10

2. В аквариумы налить по 10 л контрольной и тестируемой воды, содержащей пестициды, и поместить по 10 рыб. Воду аэрировать с помощью микрокомпрессора.

Внимание! Так как исследуемое вещество плохо растворимо в воде, разрешается использование растворителей (спирта, ацетона и др.) с целью получения раствора или устойчивой эмульсии. В случае использования этанола его концентрация должна быть не более 10,0 мг/л для острых опытов и 1,0 мг/л для хронических. При использовании растворителя следует ставить второй Контроль с растворителем.

  • 3. Основным показателем токсичности среды является выживаемость рыб. Наблюдения за выживаемостью проводить раз в сутки в течение 96 ч, подсчитывая выживших и удаляя погибших.
  • 4. Время гибели рыб отмечать по наступлению неподвижности (иммобилизации): рыбы не подают признаков жизни в течение 5 минут после прикосновения к ним стеклянной палочкой. Данные выживаемости рыб во времени при разных концентрациях пестицидов записать в таблицу 9.

Если в любой учитываемый период времени гибнет 50% и более рыб, то биотестирование прекращается. При кратковременном биотестировании рыб не кормить.

  • 5. При обработке результатов эксперимента провести сравнение показателей подопытных и контрольных рыб. Определение достоверности отклонения от контроля осуществить стандартными методами вариационной статистики.
  • 6. Можно сделать вывод о наличии хронического токсического действия воды на основании достоверности различия выживаемости рыб в контроле и тестируемой воде через 30 суток.

Результаты биотестирования занести в таблицу 9.

7. При гибели более 50% рыб, как в остром, так и в хроническом экспериментах вода считается токсичной.

Форма записи результатов биотестирования при определении токсического действия на гуппи (данио)

Время от начала опыта, ч

Тестируемая вода с разными концентрациями пестицидов

Оборудование, материалы и реактивы: аквариумы объёмом 200, 50 и 10 л, микрокомпрессоры; рыбы — гуппи и данио; сачки, корм для рыб; 50 мл исходного раствора пестицида (например, гек- сохлоран, симазин, 2,4D) в концентрации 10′ 3 ’10’ 4 (0,001-0,0001 %) в 2%-ной сахарозе.

Читайте также:  Аквариумные рыбки действительно все аквариумные?
Ссылка на основную публикацию